哈尔滨医科大学考研网(哈尔滨医科大学考研网招生信息网)




哈尔滨医科大学考研网,哈尔滨医科大学考研网招生信息网

微科盟原创微文,欢迎转发转载。

导读

抑郁症是最常见的精神病,其发病机制尚不清楚。目前,关于抑郁症发病机制的研究主要集中在大脑。肝脏可以通过肝-脑轴调节大脑功能,这表明肝脏在抑郁症的发展中起着重要作用。本研究旨在基于非靶向代谢组学技术,探讨槲皮素对慢性不可预知温和应激(CUMS)诱导的大鼠肝脏代谢变化的保护作用及其相应机制。在这项研究中,96只雄性大鼠被分为六组:对照组(C)、不同剂量的槲皮素(10mg/kg bw,Q1或50mg/kg bw,Q2)、CUMS(D)和CUMS+不同剂量槲皮素(DQ1和DQ2)。CUMS建模8周后,我们采集肝脏样本进行代谢组学分析,共鉴定出17种改变的代谢物,包括D-谷氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、甘氨石胆酸、L-高胱氨酸、前列腺素PGE2、白三烯E4、胆酸、5-甲基四氢叶酸、牛磺脱氧胆酸、S-腺苷同型半胱氨酸、脱氧胆酸、叶酸、L-蛋氨酸、白三烯C5、雌三醇-17-葡萄糖苷酸、PE和PC,表明蛋氨酸代谢、胆汁酸代谢和磷脂酰胆碱生物合成是CUMS诱导的肝脏代谢紊乱的主要途径。肝脏甲基化损伤可能在抑郁症的病理生理学中发挥作用,首次发现肝脏蛋氨酸代谢异常就证明了这一点。肝脏胆汁酸的异常变化可能为抑郁症的发病机制提供了更有力的证据,涉及微生物群-肠-脑轴,这表明肝脏参与抑郁症的发展,可能是治疗靶点。槲皮素减轻了CUMS诱导的肝脏代谢紊乱,提示槲皮素可能通过调节肝脏代谢来预防抑郁症。

论文ID

原名:Quercetin Modulates Liver Metabolic Profile in the Chronic Unpredictable Mild Stress Rat Model Based on Metabolomics Technology

译名:代谢组学分析揭示槲皮素在慢性不可预测轻度应激大鼠模型中的调节作用

期刊:Food Function

IF:6.317

发表时间:2023.01

通讯作者:赵秀娟

通讯作者单位:哈尔滨医科大学

实验设计

实验结果

1. 在CUMS和槲皮素处理过程中,抑郁症样表型发生变化

CUMS是一种被广泛接受且有效的啮齿动物抑郁模型。CUMS的主要目标是在大鼠中产生行为缺陷(如无快感和行为绝望)。用于评估CUMS后无食欲的主要测试是测量糖偏好的测试。在我们的调查中,每周评估蔗糖偏好,八周后试验结束(图1)。我们的结果表明,D组的蔗糖偏好显著低于对照组,这表明我们的CUMS模型是成功的,可以用于研究槲皮素对抑郁症肝损伤发展的贡献。与D组相比,高剂量槲皮素处理抑郁症大鼠时,蔗糖偏好显著增加。DQ1组的蔗糖消耗量显著低于对照组(P<0.01),但与D组无显著差异(P>0.05)。这些结果表明,高剂量槲皮素改善了大鼠模型中的抑郁样行为。

图1 实验步骤

2. 槲皮素对CUMS致肝损伤的影响

与C组相比,CUMS组大鼠的肝脏重量降低了19.27%。然而,高剂量槲皮素处理恢复了大鼠的肝脏重量(图2A)。不同组肝脏病理切片的代表性图像如图2I所示。C、Q1和Q2组大鼠的肝组织显示出正常的组织结构。在D组和DQ1组中,大鼠肝脏表现出肝小叶结构紊乱、肝细胞肿胀和细胞质稀释的迹象,伴有炎性细胞浸润和坏死灶(黑色箭头)。而DQ2组仅有轻微炎性细胞浸润,表明50mg/kg体重的槲皮素部分缓解了CUMS引起的肝脏损伤。

表1 正离子和负离子模式下的不同代谢物

检测血清中丙氨酸氨基转移酶( ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性,以确定槲皮素对CUMS诱导的生化改变的影响。我们研究的双因素ANOVA主要效应(CUMS和槲皮素)和相互作用值(CUMS×槲皮素)如图2B和C所示。血清中ALT和AST活性升高通常表明肝细胞损伤。如图2B和C所示,与对照组相比,CUMS组血清中ALT活性增加1.73倍,AST活性增加1.55倍(P<0.05)。相反,高剂量槲皮素处理后ALT和AST活性显著降低(P<0.05)。DQ1组ALT和AST活性略有下降,但与D组相比无统计学意义(P>0.05)。C、Q1和Q2组之间无显著差异(P>0.05)。

图2 CUMS和槲皮素处理对肝损伤的影响

(A)肝脏重量(双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=12.69,P=0.0008;槲皮素:f(5,54)=3.4,P=0.0408;相互作用:f(5,54)=11.19,P<0.0001)。(B和C)血清中ALT和AST的活性(ALT:双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=585.67,P<0.0001;槲皮素:f(5,54)=14.38,P<0.0001;相互作用:f(5,54)=23.25,P<0.0001。AST:双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=98.65,P<0.0001;槲皮素:3.35,P=0.0356;相互作用:f(5,54)=5.69,P=0.0057)。(D)肝脏中SOD的活性(双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=58.94,P<0.0001;槲皮素:f(5,54)=3.44,P=0.0391;相互作用:f(5,54)=3.09,P=0.0539)。(E)肝脏MDA水平(双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=56.91,P<0.0001;槲皮素:f(5,54)=5.22,P=0.0084;相互作用:f(5,54)=5.86,P=0.005)。(F)肝脏中GSH水平(双因素方差分析:CUMS:F(5,54)=63.23,P<0.0001;槲皮素:f(5,54)=3.70,P=0.0311;相互作用:f(5,54)=6.69,P=0.0025)。(G)肝脏GSSG水平(双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=550.31,P<0.0001;槲皮素:f(5,54)=103.39,P<0.0001;相互作用:f(5,54)=101.87,P<0.0001)。(H)肝脏中GSH/GSSG的比率(双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=466.28,P<0.0001;槲皮素:f(5,54)=11.67,P<0.0001;相互作用:f(5,54)=26.27,P<0.0001)。(I)H&E染色的代表性肝组织切片(×200,黑色箭头表示炎性细胞浸润)。条形图上的上标小写字母表示0.05水平的显著差异;相同的字母表示没有显著差异,而不同的字母表示显著差异。


我们分析了肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和丙二醛(MDA)水平的变化,以评估槲皮素对CUMS诱导的氧化反应的作用(图2D–H)。GSH和SOD都是重要的抗氧化剂,可以清除过量的活性氧以防止细胞损伤。GSH和SOD被认为是抗氧化能力的衡量指标。GSH很容易被自由基和活性氧氧化成GSSG。GSSG水平和GSH/GSSG比值被认为是氧化应激的指标。我们研究的双因素方差分析主要效应(CUMS和槲皮素)和相互作用值(CUMS×槲皮素)如图2D–H所示。事后检验表明,与对照组相比,CUMS组SOD和GSH水平以及GSH/GSSG比值显著降低,MDA和GSSG水平升高(P<0.05)。与D组相比,槲皮素降低了DQ2组的MDA和GSSG水平,增加了SOD和GSH水平以及GSH/GSSG比值(P<0.05)。这表明,每千克体重50毫克槲皮素可以保护肝脏免受CUMS诱导的氧化损伤。与D组相比,DQ1组MDA和GSSG水平降低(P<0.05),GSH/GSSG比值升高(P<0.05);SOD和GSH水平无统计学差异(P>0.05)。

图3 肝脏样本中的代谢谱

(A和B)分别在正离子模式和负离子模式下的PCA得分图。(C和D)分别在正离子模式和负离子模式下的PLS-DA评分图。(E和F)分别在正模式和负模式下对PLS-DA模型进行了200次随机排列检验。

3.肝脏代谢谱分析

为了更好地了解CUMS和槲皮素如何影响肝脏代谢,我们通过UPLC-MS进行了非靶向代谢谱分析。首先,我们使用PCA研究了正模式和负模式的全部代谢差异(图3A和B)。结果表明,不同的样品组有很好的区分。同时,QC样品紧密聚集,m/z的相对SD、保留时间和峰值强度均低于0.3%,表明该仪器具有优异的稳定性。

然后我们执行监督方法PLS-DA,以测试一组样本是否能够区分正离子和负离子模式的组(图3C和D)。C组和Q1或Q2组之间没有明显的分离趋势,但D组和C组之间发现明显的组分离。此外,D组和DQ1组之间存在一些重叠,D组与DQ2组完全分离。我们的数据显示,槲皮素或许能够减少CUMS诱导的肝脏代谢异常的影响。

为了防止过度拟合,PLS-DA模型在不同离子模式下通过200次随机排列检验和7倍交叉验证程序进行了验证(图3E和F)。在正模式下,R2Y和Q2分别为0.979和0.97,在负离子模式下分别为0.984和0.973。因此,该模型具有更好的预测能力和较低的过度拟合风险。相应的CV-ANOVA结果如表S1和S2†所示。

图4 潜在代谢产物的鉴定

(A和B)分别在正离子模式和负离子模式下,来自C组与D组的肝脏样品的OPLS-DA评分图;(C和D)分别在正离子模式和负离子模式下,D组与DQ2组的肝脏样品的OPLS-DA评分图;和(E)各组中不同代谢物的热图。红色代表高表达;白色表示平均表达式;蓝色表示低表达。(F)已鉴定代谢物的ROC曲线。

4. 肝脏中代谢物的鉴定

在肝脏样本中,我们分别在正离子和负离子模式下检测到共 17815种代谢物和5022种代谢物;根据VIP>1和S图>0.5,分别在正离子和负离子模式下过滤3238个代谢物和1761个代谢物。OPLS-DA用于模拟各组之间的差异。结果表明,D组和C组以及D组和DQ2组之间的差别最大(图4A–D)。最后,我们共鉴定了17种潜在代谢物(表1)。代表性代谢物的MS/MS谱和代谢物的离子强度如图S1和表S3†所示。热图中显示了各组的代谢产物强度(图4E)。热图的红蓝颜色强度反映了表达水平。除了D-谷氨酸,与对照组相比,CUMS组的L-腺苷甲硫氨酸(SAM)和甘氨石胆酸(LGC)水平显著降低(P<0.05),而L-高胱氨酸(Hcy)、前列腺素PGE2、白三烯E4、胆酸(CA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、脱氧胆酸(DCA)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、叶酸、L-蛋氨酸(MET)、白三烯C5、磷脂酰乙醇胺(PE,16:0/22:6(4Z、7Z、10Z、13Z、16Z、19Z))、雌三醇-17-葡萄糖醛酸、磷脂酰胆碱(PC,16:0/P-18:0)水平升高(P<0.05)。高剂量的槲皮素补充恢复了CUMS大鼠的代谢产物水平(P<0.05),而除TDCA(P<0.05)外,DQ1组的代谢产物水平没有恢复(P>0.05)。

随后,我们使用ROC曲线测试代谢物的预测能力,并计算曲线下面积(AUC)值(图4F)。通常,AUC>0.7表示良好的预测能力。我们鉴定的17种代谢产物显示出良好的预测性能,估计AUC>0.9。最后,我们进行了通路富集分析,以全面观察生物途径。

图5 槲皮素调节CUMS诱导的大鼠肝损伤的代谢途径图

(A)蛋氨酸代谢;(B)精胺和精胺生物合成;(C)甲基组氨酸代谢;(D)胆汁酸代谢;和(E)磷脂酰胆碱生物合成。红色显示的代谢产物是不同的代谢产物。黑色实心箭头:D组肝脏代谢产物与对照组相比的变化方向。黑色虚线箭头:与D组相比,DQ2组肝脏代谢产物的变化方向。缩写:AMP,腺苷一磷酸;ATP,三磷酸腺苷;CDCA,鹅去氧胆酸;COA,辅酶A;DG,二酰甘油;DNMT,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶原;GC,甘氨酸;GCA,甘胆酸;LCG,石胆酸甘氨酸缀合物;LCT,石胆酰牛磺酸;MS,蛋氨酸合成酶;MTHFR,亚甲基四氢叶酸还原酶;PLA2,磷脂酶A2;SAHH,S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶;SAMT,S-腺苷蛋氨酸;SHMT,丝氨酸羟甲基转移酶;SM,精胺;SMD,亚精胺;SMS,精胺合成酶;TCA,牛磺胆酸;TCDCA,牛磺脱氧胆酸。

5. 通路分析

通过将代谢产物信息映射到KEGG和SMPDB数据库获得途径富集分析结果;结果如图S2†所示。17条途径在广泛参与胆汁酸、氨基酸和脂肪酸生物合成和代谢的代谢产物中富集。最终,9种内源性代谢途径与CUMS和槲皮素处理显著相关(P<0.05),包括甜菜碱、甲基组氨酸、蛋氨酸、磷脂酰胆碱、胆汁酸、儿茶酚胺、精胺和精胺、肉碱和泛醌的代谢。基于代谢途径的结果,我们描绘了与CUMS和槲皮素处理相关的代谢网络(图5)。

6. 肝脏代谢相关指标检测

为了解释相关代谢途径,我们检测了相关途径中的关键化合物(包括MAT和LXRα)。我们研究的双因素方差分析主要效应(CUMS和槲皮素)和相互作用值(CUMS×槲皮素)如图6所示。事后试验表明,与C组相比,CUMS降低了MAT的活性,并增加了肝脏中LXRα的水平(P<0.05)。此外,每千克体重50毫克槲皮素的处理显著逆转了CUMS诱导的MAT活性和LXRα水平(P<0.01)。C组、Q1组和Q2组之间无显著差异(P>0.05)。

图6 槲皮素对代谢相关指标的影响

(MAT:双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=94.82,P<0.0001;槲皮素:f(5,54)=5.22,P=0.0085;相互作用:f(5,54)=1.68,P=0.1960。LXRα:双因素方差分析:CUMS:f(5,54)=9.88,P=0.0027;槲皮素:f(5,54)=3.47,P=0.0384;相互作用:f(5,54)=5.58,P=0.0063)。条形图上的上标小写字母表示0.05水平的显著差异;相同的字母表示没有显著差异,而不同的字母表示显著差异。

在我们的研究中,CUMS导致大鼠肝脏重量下降,这可能归因于应激诱导的氧化应激、炎症和代谢失衡,所有这些都导致应激大鼠肝脏体重下降。组织病理学、肝脏代谢谱和氧化指数以及血清生化参数均证实了这一假设,显示了CUMS诱导的肝损伤和槲皮素对大鼠的保护作用(图2B–I和4A–D)。我们的结果表明,在大鼠肝脏中发现了17种潜在代谢产物(表1)。槲皮素改善CUMS诱导的肝损伤的可能代谢途径如图5所示,主要包括甲基化反应、胆汁酸代谢和磷脂酰胆碱生物合成。

1. 蛋氨酸代谢

在这项研究中,我们首次发现了CUMS诱导的肝脏蛋氨酸代谢紊乱。四种代谢产物(MET、SAM、SAH和Hcy)对槲皮素改善蛋氨酸代谢具有重要影响(图5A)。在体内,SAM主要由MET、叶酸、甜菜碱或胆碱在肝脏中形成。SAM是许多生化反应中甲基和硫酸盐基团的主要供体。缺乏甲基供体可能导致中枢神经系统紊乱,如抑郁症。SAM可能通过改变血浆磷脂甲基化而具有抗抑郁作用,从而改变膜的流动性和渗透性。在我们的研究中,在CUMS诱导的大鼠肝脏中SAM水平降低,MET水平升高(图4E),表明CUMS诱导了蛋氨酸代谢紊乱。我们推测这种变化可能与MAT(催化MET转化为SAM的关键酶)的活性有关。为了证实这一推测,我们在肝脏中检测到MAT的活性。研究结果表明,槲皮素显著逆转了CUMS导致的MAT下降(图6),提示槲皮素可能通过调控MAT的活性来影响MET和SAM水平。

所有SAM依赖的甲基化反应产生甲基化产物和SAH,如甲基组氨酸代谢。SAM依赖性甲基转移酶将SAM转化为SAH。SAM和SAH也是合成儿茶酚胺和精胺所必需的(图5B和C)。SAM和SAH的比率反映了机体的甲基化能力。在我们的研究中,CUMS大鼠模型的甲基化能力因SAM/SAH比率的降低而降低(图S3†),这可能进一步导致DNA稳定性降低、神经递质产生受损和大脑神经冲动传导受损。DQ2组SAM/SAH比率增加(图S3†)表明槲皮素可能通过调节肝脏甲基化在抑郁症中发挥保护作用。

SAH也可以转化为Hcy,肝脏被认为是体内负责Hcy代谢的主要器官。当肝细胞不能充分处理Hcy的代谢时,Hcy的血清水平将显著升高。血清中的Hcy不仅可以影响神经递质相关基因的表达,还可以作为N-甲基D-天冬氨酸受体激动剂,影响神经元功能,最终导致抑郁症。在正常情况下,Hcy浓度由两种途径调节,即重新甲基化Hcy以产生MET或将Hcy分解为GSH。GSH除了作为自由基清除剂外,还参与信号转导和转录因子分子功能的修饰。我们的研究结果表明,槲皮素显著减少了CUMS诱导的SAH和Hcy积累(图4E),并恢复了GSH的损失(图2F),提示槲皮素可能通过调节GSH水平来影响肝脏中Hcy的水平。

此外,GSSG通常被视为GSH代谢的副产物。GSH/GSSG比值通常用于评估肝脏氧化还原状态。半胱氨酸或MET等氨基酸在GSH/GSSG氧化还原对中发挥调节作用。在大鼠中,CUMS显著增加GSSG积累并降低GSH/GSSG比率(图2G和H),表明肝脏氧化应激。大鼠肝脏的高氧化应激可导致海马神经元损伤和低水平的脑源性神经营养因子,进而进一步促进抑郁症的发展。槲皮素处理后,GSH/GSSG的比率增加(图2H),表明槲皮素可能通过调节肝脏的氧化还原状态来保护神经系统,这可能与槲皮素的强大抗氧化活性有关。

2. 胆汁酸代谢

胆汁酸是由肝脏中的胆固醇合成的。初级胆汁酸在肠道菌群的作用下可产生次级胆汁酸(TDCA、DCA和LCG)(图5D)。肝脏中胆汁酸的前体胆固醇在大脑中含量丰富。此外,胆汁酸可能通过胆汁酸转运蛋白进入大脑。LXRα是一种参与胆固醇吸收、运输、排泄和转化为胆汁酸的核受体。据报道,LXRα的丢失阻碍了胆固醇向胆汁酸的转化。我们推测D组胆汁酸(DCA、CA和TDCA)水平的增加(图4E)与肝脏中LXRα的水平有关。CUMS组的LXRα水平显著增加(图6),进一步证实了我们的推测。值得注意的是,高剂量槲皮素显著降低了CUMS大鼠肝脏中的胆汁酸和LXRα水平(图4E和6),表明槲皮素可能能够通过控制LXRα的水平来改善CUMS诱导的肝脏胆汁酸代谢紊乱。

胆汁酸代谢和胆汁酸池的稳态是全身代谢的重要组成部分。胆汁酸可以影响肠道微生物群组成的动态。最近的证据表明,肠道微生物群可以通过微生物群-肠道-大脑轴调节大脑功能和行为。本研究中观察到的胆汁酸的变化提醒我们,槲皮素可能通过改变胆汁酸的代谢来改变肠道微生物群的组成,从而起到抗抑郁的作用。此外,槲皮素还通过抑制或刺激某些细菌的生长以及改变特定微生物组的丰度来影响肠道环境。

3. 磷脂酰胆碱生物合成

PC和PE是所有细胞中最丰富的膜磷脂,并参与所有细胞膜的结构组成。近年来,脂蛋白、脂质和全身能量代谢的调节与磷脂代谢有关。据报道,肝脏脂质的改变可能会影响大脑的功能。在我们的研究中,每千克体重50毫克槲皮素显著逆转了CUMS诱导的PC和PE水平的增加(图4E和5E),表明槲皮素可以通过调节肝脏脂质代谢来保护脑功能。

据估计,人体膳食中槲皮素摄入量为3-40 mg day−1(以苷元当量表示)。在这项研究中,高剂量的槲皮素(每千克体重50毫克)可以改善CUMS诱导的大鼠抑郁样行为;这相当于每天服用489mg槲皮素,可以改善60公斤体重的人的抑郁症状。可以看出,槲皮素的人体等效剂量大大超过了槲皮素的估计人体膳食摄入量。此外,根据美国农业部(USDA)关于所选食品中类黄酮含量的数据库,槲皮素的人体等效剂量(489 mg day−1)相当于成年人体每天摄入690.7 g萝卜叶。虽然通过膳食摄入人体等效剂量的槲皮素是不合理的,但该剂量可通过每日口服补充剂提供(每个胶囊或片剂含有约500mg槲皮素)。在4至8周内每日重复摄入500 mg槲皮素后,受试者未报告任何不良事件,这表明槲皮素作为膳食补充剂可能是临床上可行的替代品。应进一步调查槲皮素作为食品补充剂在普通人群中的抗抑郁作用。

结论

这项研究仍有几个局限性。首先,UPLC-MS用于鉴定大鼠肝脏中的代谢产物,这可能导致一些非极性代谢产物无法鉴定。我们应使用气相色谱-质谱仪(GC-MS)进行进一步研究,以获得更多关于非极性代谢物的信息。此外,我们还需要更多的实验来进一步研究槲皮素对CUMS诱导的与三种主要代谢途径相关的肝脏代谢异常的保护作用机制。

本研究通过UPLC-MS分析肝脏代谢谱,以探讨槲皮素对CUMS诱导的肝损伤的保护作用。我们共鉴定了17种改变的代谢产物,通路分析结果表明,每千克体重50毫克槲皮素可以通过调节甲基化反应、胆汁酸代谢和磷脂酰胆碱生物合成来保护CUMS诱导的肝脏代谢紊乱。更重要的是,CUMS引起的肝脏蛋氨酸代谢紊乱首次被发现,这表明肝脏甲基化损伤可能是抑郁症更复杂的病理生理学的一个组成部分。此外,CUMS引起的肝胆汁酸异常改变可能为抑郁症的发病机制提供了更令人信服的证据,涉及微生物-肠-脑轴,这表明肝脏可能在抑郁症的发病过程中发挥关键作用,是治疗干预的潜在靶点。槲皮素作为一种植物化学物质,可能通过调节肝脏代谢在抑郁症中发挥保护作用。

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/fo/d2fo03277e

福利时刻购买细胞及相关实验,扫码或加微信(1278317307)入群。

本公众号已与浙江慧通测评动物实验中心搭建紧密的合作关系:该动物中心已获得动物使用许可,如您需要含药血清制备-成分分析灌胃给药造模药理、毒理以及相关实验技术服务,欢迎联系我们!

福利时刻毕业季找工作点击链接,多家企业30W+年薪工作招聘任你选(赶紧点击进入注册,上传简历吧~ ) 。

哈尔滨医科大学考研网(哈尔滨医科大学考研网招生信息网)

未经允许不得转载:上海考研网 » 哈尔滨医科大学考研网(哈尔滨医科大学考研网招生信息网)

赞 (0) 打赏

觉得文章有用就打赏一下文章作者

支付宝扫一扫打赏

微信扫一扫打赏